Herton Escobar | Agência FAPESP – Pesquisadores da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) se inspiraram na cabeça luminosa de uma larva de besouro para desenvolver um sistema avançado de bioluminescência, aplicável ao imageamento de processos biológicos e patológicos em mamíferos.

O inseto em questão é a larva-trenzinho, da espécie Phrixotrix hirtus, que ocorre quase que exclusivamente no Brasil e é o único organismo conhecido capaz de produzir bioluminescência de cor vermelha. A enzima responsável por gerar essa luz na cabeça do animal foi clonada no fim da década de 1990 pelo bioquímico brasileiro Vadim Viviani, durante um pós-doutorado no Japão.

Agora, cerca de 25 anos depois, seu grupo de pesquisa na UFSCar acaba de criar uma ferramenta de investigação, baseada numa versão mutante dessa molécula e em química combinatória.

A nova luciferase – como são chamadas as enzimas produtoras de bioluminescência – permite observar a ocorrência de fenômenos biológicos e patológicos como câncer e infecções em tempo real no organismo de mamíferos, mesmo em camadas profundas de tecido, com maior eficácia do que as tecnologias atualmente disponíveis.

O uso da bioluminescência para pesquisa em mamíferos é especialmente desafiador, porque seus organismos são ricos em hemoglobina, mioglobina, melanina e outros pigmentos naturais que absorvem a luz gerada na maioria das reações bioluminescentes (de tonalidade azul, verde ou verde-amarelo), dificultando a sua detecção. Na prática, isso limita a aplicação da técnica em diversas situações envolvendo modelos animais que são fundamentais para as ciências biomédicas, como ratos, camundongos e coelhos.

“Por isso existe a necessidade de sistemas que emitem luz vermelha, especialmente na faixa do vermelho distante; a luz vermelha passa facilmente por esses tecidos, inclusive tecido ósseo”, explica Viviani à Agência FAPESP. É exatamente isso que seu grupo de pesquisa vem desenvolvendo na UFSCar, em colaboração com cientistas de outras instituições do Japão.

O avanço mais recente desse esforço é um novo sistema capaz de gerar bioluminescência na faixa do vermelho distante – com comprimentos de onda acima de 650 nanômetros (nm) –, de forma mais brilhante, estável e duradoura do que os sistemas atuais.

À esquerda, o novo sistema criado por cientistas da UFSCar; à direita, o sistema comercial Akaluc/AkaLumine, o mais usado atualmente (imagem: Gabriel Felder Pelentir)

Os resultados do estudo, apoiado pela FAPESP (processos 22/03538-0, 20/07649-6 e 17/22262-8), foram publicados na revista Chemical & Biomedical Imaging. A pesquisa também é financiada pela FAPESP por meio do Projeto Temático “Bioluminescência: biodiversidade; origem metabólica; estrutura/função e engenharia de luciferases; empregos em biossensores, bioensaios e bioindicação ambiental”, liderado por Viviani e sediado no Centro de Ciências e Tecnologias para a Sustentabilidade (CCTS) da UFSCar, em Sorocaba (SP).

Inspiração natural

Bioluminescência é a produção de luz por meio de reações químicas dentro de um organismo vivo. Ela ocorre quando as enzimas luciferases catalisam a oxidação de moléculas conhecidas como luciferinas. Várias espécies de animais, plantas, fungos e microrganismos utilizam essa capacidade luminosa para se comunicar, atrair presas ou afastar predadores. O exemplo mais conhecido é o dos vagalumes, que usam seu pisca-pisca para atrair parceiros.

No caso da larva-trenzinho, a bioluminescência parece servir a duas funções. Ela possui lanternas verdes espalhadas pelas laterais do corpo, que acendem quando o inseto é tocado ou se sente ameaçado, aparentemente como uma forma de assustar predadores. Já a luz vermelha da cabeça “é mais enigmática”, segundo Viviani. Pesquisadores suspeitam que ela sirva como um tipo de lanterna, para iluminar o ambiente noturno enquanto a larva busca por comida em meio ao folhiço, no chão da mata. Como a maioria dos organismos terrestres possui pouca sensibilidade à luz vermelha, essa seria uma forma de iluminar suas presas sem ser detectada por elas nem chamar a atenção de predadores, avalia Viviani.

Gene-repórter

Luciferases extraídas da natureza ou sintetizadas em laboratório já são usadas há décadas em pesquisas científicas para observar e monitorar sistemas biológicos, tanto em modelos in vitro (como culturas de células) quanto in vivo (em modelos animais), por meio da bioluminescência. Elas funcionam como biossensores, ou “genes-repórteres”, que produzem luz ao encontrar uma situação ou um fenômeno específico que os cientistas desejam estudar – por exemplo, para sinalizar a expressão de determinados genes, indicar mudanças de pH ou alertar para a presença de bactérias patogênicas. O leque de possíveis aplicações é amplo, incluindo a detecção de processos metastáticos (quando células cancerígenas se espalham pelo corpo), o rastreamento de infecções e o monitoramento de reações metabólicas e processos bioquímicos diversos envolvidos no desenvolvimento de fármacos.

A aplicação dessas tecnologias em pesquisas com mamíferos, porém, ainda é limitada em função da absorção da luz pelos tecidos circundantes. Inspirados pelo brilho vermelho da larva-trenzinho, então, Viviani e seus colaboradores se propuseram a superar esse gargalo. O primeiro sucesso veio em 2021, com a publicação de um sistema de bioluminescência na faixa do vermelho distante (650 nm), que utilizava uma versão geneticamente modificada da luciferase da Phrixotrix hirtus, acoplada a uma luciferina sintética, produzida por colaboradores da Universidade de Eletro-Comunicações em Tóquio, no Japão (leia mais em: agencia.fapesp.br/35157 e agencia.fapesp.br/31554).

Esse primeiro sistema já era superior aos disponíveis no mercado, mas os pesquisadores não se deram por satisfeitos. O novo trabalho, publicado agora, descreve um sistema ainda melhor do que o de 2021, mais luminoso e com um comprimento de onda ainda maior (chegando a 660 nm).

Segundo Viviani, o resultado deriva de uma combinação de técnicas de química combinatória com engenharia genética. “De um lado você modifica o substrato, que é a luciferina, para emitir uma luz vermelha; e do outro, você modifica a luciferase que aceita esse substrato, tentando aumentar o brilho e deslocar a luz ainda mais para o vermelho distante”, explica o professor.

A larva-trenzinho é o único organismo conhecido capaz de produzir bioluminescência de cor vermelha (imagens: Vadim Viviani/Gene Reports, 2017 e Scientific Reports, 2019)

Engenharia genética

O primeiro autor do artigo é o biólogo Gabriel Felder Pelentir, doutorando orientado por Viviani pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Partindo do conhecimento que o grupo já tinha acumulado sobre a estrutura molecular da luciferina da larva-trenzinho, ele resolveu testar se era possível melhorar ainda mais a performance do sistema, modificando os aminoácidos que compõem o sítio ativo da molécula – ou seja, que fazem o encaixe da luciferase com a luciferina.

“A gente escolhe o aminoácido que quer mudar e faz todas as mutações de aminoácidos que podem ocorrer ali, para avaliar quais são as melhores”, explica Pelentir.

Viviani destaca que esse trabalho só pôde ser realizado graças a outro projeto de doutorado, realizado entre 2015 e 2019 – também orientado por ele e apoiado pela FAPESP –, em que a então aluna Vanessa Rezende Bevilaqua, usando análogos maiores de luciferina, mostrou que a luciferase da larva-trenzinho tem sítio ativo maior do que o das luciferases clássicas de vagalumes. Foi esse conhecimento, segundo ele, que abriu caminho para adequar por engenharia genética o sítio ativo da enzima.

Bevilaqua, hoje professora da Pontifícia Universidade Católica, em Sorocaba, também é autora do trabalho. Ela e Pelentir testaram o novo sistema em células de mamíferos e mostraram que ele teve performance superior à do sistema comercial Akaluc/AkaLumine, que é o mais usado para aplicações na faixa do vermelho distante ou infravermelho próximo.

No rastro dos vagalumes

Para Pelentir, o projeto é uma oportunidade de unir duas paixões: a bioquímica e a bioluminescência. “Eu adorava caçar vagalumes quando era pequeno”, lembra o jovem doutorando, de 26 anos. “As pessoas não fazem ideia de como é bonita e como é incrível a bioluminescência. Então, unir esse fenômeno com pesquisa e bioquímica é o que me motiva.”

O Brasil abriga a maior diversidade de insetos bioluminescentes do planeta, segundo Viviani. De um total de 2.500 espécies descritas no mundo, cerca de um quinto (500) está no Brasil. “Só que o número deve ser bem maior, porque tem muitas espécies que ainda não foram descobertas ou não foram descritas nem na Mata Atlântica nem no Cerrado, e muito menos na Amazônia”, observa o pesquisador. “E a gente sabe que não é só bonito; tem utilidade para a ciência e, claramente, para inovação tecnológica”, completa.

Além das aplicações em biomedicina, as luciferases também são usadas como biossensores na área ambiental para a detecção de poluentes e outras substâncias tóxicas.

O laboratório de Viviani na UFSCar abriga o maior banco de luciferases do mundo, com cerca de 20 luciferases selvagens, isoladas da biodiversidade brasileira, e centenas de versões mutantes dessas enzimas. Várias dessas moléculas e suas aplicações já foram patenteadas (leia mais em: revistapesquisa.fapesp.br/verde-amarelo-ou-vermelho/).

O artigo Brighter NIR bioluminescence system for mammalian cell bioimaging based on engineered railroadworm luciferase and 6′-aminoluciferin analogues pode ser lido em: pubs.acs.org/doi/10.1021/cbmi.5c00163.